ATCC細(xì)胞株穩(wěn)定整合試驗中的幾個關(guān)鍵因素：

　　1)，外源插入片段的拷貝數(shù)。多數(shù)情況下，低拷貝甚至是單拷貝可以減少人為實驗因素的干擾。

　　2)，整合的幾率，這不僅決定了穩(wěn)定株篩選的難易程度，而且還可以幫助人們更容易得到混合穩(wěn)定株。

　　3)，整合位點的轉(zhuǎn)錄活躍度，決定了穩(wěn)定株中外源片段的表達質(zhì)量。理想的狀況是單拷貝，但轉(zhuǎn)錄活性比較高。

　　4)，整合后的穩(wěn)定性。不同的整合位點決定了外源片段在染色體中的穩(wěn)定性，有些區(qū)域易發(fā)生重組或者丟失，從而導(dǎo)致穩(wěn)定株再次丟失的情況。

　　5)，使用混合穩(wěn)定株或者獲得多個不同單克隆穩(wěn)定株。因為穩(wěn)定整合往往伴隨這插入失活宿主內(nèi)源基因，所以實驗時通過使用混合穩(wěn)定株，或者對多個單克隆穩(wěn)定株進行比較，可以幫助研究人員獲得更的實驗數(shù)據(jù)。

　　凍存的ATCC細(xì)胞株和雜交腐細(xì)胞株在運送過程中使用干冰保持低溫。收到細(xì)胞后，可以立即解凍復(fù)蘇，去除二甲基亞砜（DSMO0）后進行細(xì)胞培養(yǎng)。如果不立即復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞，必須將細(xì)胞凍存管放置于液氮罐氣相層儲存。請不要將細(xì)胞存儲在-130℃以上的溫度。如果溫度不夠低，達不到-130℃，細(xì)胞活力會立即下降。

　　ATCC細(xì)胞的培養(yǎng)試劑分析：

　　一、紡錘體阻斷劑

　　在有絲分裂過程中，隨著紡錘絲的形成，染色體被牽引到一起難以觀察其形態(tài)。紡錘體的形成在于細(xì)胞質(zhì)和紡錘體成分的粘度之間的平衡，因此，改變細(xì)胞質(zhì)的粘度，即可破壞紡錘體形成，從而使得染色體均勻散開，且染色體縊痕區(qū)更為清楚。

　　在培養(yǎng)中使用的紡錘體阻斷劑為秋水仙素，在終止培養(yǎng)前加入適量秋水仙素，使正在分裂的細(xì)胞停留在中期，以獲得大量分裂相供分析之用。秋水仙素的濃度范圍比較寬，一般使用濃度0.05-0.8微克/毫升，在終止培養(yǎng)前處理2-4小時。但在實際工作中需要借助濃度和處理時間來控制染色體的收縮程度。秋水仙素作用時間越長，被阻斷的中期分裂相越多，但是染色體也越凝聚和收縮，所以還視各實驗室經(jīng)驗而定。

　　二、ATCC細(xì)胞低滲液

　　低滲液是指滲透壓和離子強度均低于正常細(xì)胞生理條件的溶液，如水、低滲的檸檬酸鈉或氯化鈉、甘油磷酸鉀（0.65M）、KCl（0.075M）等。低滲效果取決于低滲液的化學(xué)組成、低滲的溫度和處理時間。低滲處理是憑借反滲透作用使細(xì)胞膨脹染色體鋪展，同時可使粘附于染色體的核仁物質(zhì)散開，以便能在一個平面上觀察所有染色體形態(tài)。實驗室中一般選用0.075MKCl為低滲液（具體情況取決于實際操作，鑒于實驗的連續(xù)性和穩(wěn)定性，本實驗室采用0.35%KCl），其優(yōu)點有：

　　1.染色體輪廓清楚，可染色性強，染色時間短。

　　2.用于顯帶染色時能充分顯示帶型特點。低滲處理為37℃，15-25分鐘，以預(yù)實驗條件為準(zhǔn)。

　　三、固定液

　　固定液的重要特性是能迅速穿透細(xì)胞，將其固定并維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性，還要能夠增強染色體的嗜堿性，達到優(yōu)良染色效果。單純的固定液一般難以達到這些要求，因此在實驗中使用兩種混和的固定液。

　　Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需臨時配制，長時間放置影響固定效果，固定時間15分鐘至24小時，冰箱、室溫均可。必要時可改變甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于細(xì)胞膨脹、染色體鋪展，但易導(dǎo)致細(xì)胞破裂、染色體散失。

　　四、滴片

　　滴片使細(xì)胞懸液從一定高處落在載玻片上，淋巴母細(xì)胞膜破裂，染色體分散開。載玻片可用冰片和干片，效果均好。滴片后需空氣干燥。

　　五、Giemsa染色

　　Giemsa染料不是一種單一染料，而是天青、伊紅、甘油和甲醇的混合物，配制后原液儲存。在常規(guī)染色中，并不比其他染料*，但在顯帶技術(shù)中，卻是*的。

　　Giemsa工作液在使用前臨時配制，濃度可在2.5-10%之間（原液2份加pH7.4磷酸緩沖液10-40份）。染色后，染色質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核是藍色。