培養(yǎng)細胞的常規(guī)檢查和觀察方法
細胞培養(yǎng)后,需要對其生長狀況、形態(tài)甚至生物學(xué)性狀連續(xù)地進行觀察.由于細胞小而復(fù)雜,若不借助適當(dāng)?shù)氖侄?則難以觀察期形態(tài)、結(jié)構(gòu),更難發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)各種組分的分子組成及功能.目前,已有多種研究細胞的技術(shù),從光學(xué)顯微鏡到電子顯微鏡,從一般細胞化學(xué)法到免疫化學(xué)法.

  細胞培養(yǎng)后,需要對其生長狀況、形態(tài)甚至生物學(xué)性狀連續(xù)地進行觀察.由于細胞小而復(fù)雜,若不借助適當(dāng)?shù)氖侄?則難以觀察期形態(tài)、結(jié)構(gòu),更難發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)各種組分的分子組成及功能.目前,已有多種研究細胞的技術(shù),從光學(xué)顯微鏡到電子顯微鏡,從一般細胞化學(xué)法到免疫化學(xué)法.
    細胞在體外培養(yǎng)過程需要每天進行常規(guī)檢查和顯微鏡觀察,及時了解細胞生長狀態(tài)、數(shù)量改變、細胞形態(tài)、細胞有無移動、污染、培養(yǎng)基pH值是否變酸、培養(yǎng)基變黃是否需要更換等.細胞常規(guī)檢查觀察的方法有4種.
一、肉眼觀察
    一般常規(guī)檢查用肉眼即可觀察,主要看培養(yǎng)基的顏色和透明度的變換.正常情況下,培養(yǎng)基pH值介于7.2-7.4之間,呈桃紅色,清亮透明.加入細胞在培養(yǎng)瓶中置一般恒溫箱培養(yǎng)時,隨著細胞生長時間的延長,細胞代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)會使培養(yǎng)基pH值下降,引起顏色變淺變黃.在超越緩沖范圍后便宜酸化變黃,如不及時調(diào)節(jié)pH值,會影響細胞的生長,甚至造成細胞退變死亡.所以,一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基變黃,應(yīng)及時換液傳代.一般更換培養(yǎng)基的時間依營養(yǎng)物的消耗而定,正常情況生長穩(wěn)定的細胞2-3天換液一次,生長緩慢的細胞3-4天換液一次.培養(yǎng)基中加Hepes或用5%CO2恒溫箱培養(yǎng)可使pH值維持穩(wěn)定,利于細胞生長.用磷酸鹽緩沖系統(tǒng)培養(yǎng)時,可因瓶及塞子漏氣,CO2溢出,也可能由于培養(yǎng)瓶塞洗刷不潔、殘留堿性物,是培養(yǎng)基變堿發(fā)紅,致使細胞難以生長,甚至死亡.細胞換液傳代后,若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基很快變黃,要注意是否有細菌污染或培養(yǎng)皿沒有洗干凈.貼壁細胞污染,也可在顯微鏡下仔細觀察有無污染現(xiàn)象出現(xiàn).
二、顯微鏡觀察
    生長良好的細胞,在顯微鏡喜愛可觀察到細胞透明度大,折光性強,輪廓不清.相差顯微鏡觀察時可見細胞部分細微結(jié)構(gòu).若細胞生長狀態(tài)不良,可見細胞輪廓增強,細胞折光性變?nèi)?細胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質(zhì),細胞之間空隙增大,細胞形態(tài)不規(guī)則,甚至失去原有細胞的特點,產(chǎn)生園縮脫落,有時細胞表面及周圍出現(xiàn)絲狀絮狀物.若細胞營養(yǎng)不良狀況沒有得到及時糾正,進一步發(fā)展可見到部分細胞死亡,崩解漂浮在培養(yǎng)基中,發(fā)現(xiàn)這種情況應(yīng)及時處理,只有生長良好的細胞才能進行傳代培養(yǎng)和實驗研究.
三、細胞的生長狀態(tài)觀察
    細胞培養(yǎng)時,經(jīng)初代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng),都有一個長短不同的潛伏期,在培養(yǎng)過程中注意觀察細胞增殖生長的狀態(tài)極為重要.各種細胞增殖的時間不盡相同.傳代細胞系,胚體組織或幼體細胞潛伏期短,一般在接種培養(yǎng)第2天即可見細胞生長增殖,3-4天便可連接成片.成體組織的潛伏期,老年組織和癌組織潛伏期更長,可達1周左右.原代細胞培養(yǎng)中zui先可見組織塊邊緣“長出”細胞,這種細胞是從原代組織塊中游走出來的,并不是細胞增勢產(chǎn)生的.這種早期游離出的細胞多以成纖維細胞為主,易生長,適應(yīng)性強,呈放射狀或旋渦狀分布,很快生長并互相連接成網(wǎng)狀.傳代細胞在傳代后,一般經(jīng)過懸浮、貼壁伸展很快進入潛伏期、對數(shù)生長期、細胞大量繁殖、逐漸相連成片而長滿瓶底.一般發(fā)現(xiàn)細胞覆蓋瓶底的80%就應(yīng)及時傳代,否則會影響細胞生長甚至導(dǎo)致細胞脫落.當(dāng)發(fā)現(xiàn)懸浮細胞生長顯著、密度增大、分布稠密、培養(yǎng)基變黃也應(yīng)及時傳代.
四、微生物污染的觀察
    細胞接種、傳代、換液加藥后經(jīng)常觀察,密切注意是否有微生物污染發(fā)生.一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基渾濁、液體內(nèi)漂浮著菌絲或細菌,或生長明顯變緩,胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多,有中毒表現(xiàn)等應(yīng)懷疑是否有微生物污染,進一步觀察檢查并及時處理.